流式新變革——追溯光譜流式發展歷史
<引言>
光譜流式技術自誕生以來，憑藉其迥異於傳統流式技術的優異特點，正以不可思議的速度進入廣大流式用戶的視野中，並不斷地吸引著眾多細胞檢測領域的研究者諮詢了解，本文為大家整理介紹了光譜流式技術的發展起源，對比了兩種流式技術的異同點。
目前最流行的細胞檢測分析技術是基於螢光的流式細胞術(Flow cytometry, FCM)，FCM因其具有同時檢測多參數和高通量的特點，已發展成為生命科學領域研究中最為廣泛使用的技術，可以用來鑑定細胞亞群，並分析特定亞群的生物學功能。
現代FCM技術誕生於上世紀60年代，歷經半個世紀的發展，從儀器構造和檢測試劑的商品化，極大地拓展了單細胞分析的參數維度。如今流式儀器已從最初的單激光逐漸增加為3根、5根乃至7根激光，更亮、覆蓋不同波長范圍的螢光素陸續開發問世，以適應流式檢測應用的試劑需求。
現代FCM技術發展變革歷程
現階段的流式檢測技術可輕鬆實現8-15色的多色方案，至多已有近30色檢測能力。然而由於不同螢光光譜天然存在重疊的特性，極大地限制了傳統流式多參數的發展能力，傳統流式技術已無力再繼續向上發展，突破超多色實驗的螢光溢漏補償限制。特別是當顏色越來越多時，傳統流式檢測技術往往會導致一些出乎我們意料之外的情況出現。
基於濾光片的傳統流式技術特點
目前的流式技術一般選擇使用二向鏡和帶通濾光片組合來接收螢光信號，因為在傳統概念上人們選擇每一種螢光素對應著某一個特定的螢光檢測通道，如此形成了現在的濾光片數目對應著螢光素檢測數量的默認原則。由於螢光素的發射光譜往往是連續廣泛分佈，導致其他檢測通道也會收集到臨近通道的螢光信息，這就需要我們在做多色實驗時，必須同時準備螢光素單染管，用來計算相鄰通道的螢光溢漏比例。
螢光染料光譜重疊示意
在過去的三十多年中，流式已經從最初的單色檢測發展到2色、3色和4色檢測，至1997年有報導提到當時可實現8色方案的流式檢測，2001年這一數字發展為11色，隨後很快更新為18色，最新的極限檢測數據是由BD公司的Symphony儀器提供的29色檢測（OMIP-63）。但對於傳統流式來說，由於螢光補償溢漏問題，一般單根激光器能配備的檢測通道在5-7個之間，基本不會超過8個。這形成瞭如今流式技術的最大製約，即顏色數量提升的難以為繼。
現代流式技術局限
隨著免疫學和診斷醫學領域的研究深入，如今的流式實驗仍然聚焦於獲得更多顏色的同時檢測，已經向30色乃至40色以上的多色方案發起了檢測需求。但基於二向鏡和濾光片原理的傳統流式已很難繼續向前突破，加之傳統流式複雜繁瑣的補償溢漏問題，在超多色方案實驗中更加凸顯，已經顯露出疲於應付的狀態。在此情況下，人們不禁開始思考是否存在其他更多更快的流式數據檢測和分析方法。
2019年ISAC關於未來流式發展趨勢的全球調研報告
針對傳統流式的技術瓶頸，研究者們發展出了光譜流式(Spectral flow cytometry) 和質譜流式(Mass cytometry)兩類高維數據分析技術，可以為研究者提供多達40色以上的單細胞超高參數分析能力，配合概率先驗性算法或無監督類的解析算法對高維數據進行降維分析，因此從根本上避免了螢光光譜重疊的補償問題。此外，獨特的光路檢測結構配合降維解析算法，使得光譜流式可以提供更好的數據分辨率。
光譜流式起源
從很早開始，人們就認識到如果可以收集到細胞的全光譜信息，那麼就能夠通過數據分析獲得樣本的更多潛在生物學信息。
對單個細胞的全光譜檢測歷史可追溯到傳統流式技術剛誕生的那一時期，在1979年Wade等人最早嘗試了使用流式系統記錄樣本的光譜信息，可惜的是當時的儀器設計不能實現單個顆粒的光譜記錄。1986年Steen和Stokke檢測了大鼠胸腺細胞的平均螢光光譜；1990年Buican使用傅立葉變換干涉儀實現了單個細胞的光譜記錄；1996年Gauci提出使用棱鏡分光配合PD陣列檢測光譜信息；2001年SoftRay公司聯合Wyoming及Utah大學的研究者，共同提出了另一套基於棱鏡的光譜檢測概念。上述早期的光譜儀結構均有檢測速度/靈敏度和光譜分辨率的不足，限制了光譜流式的繼續發展。
光譜流式概念發展起源
2005年普渡大學Robinson等人提出了使用棱鏡或光柵系統分光，配合32通道PMT或CCD檢測器陣列實現500-800 nm波長范圍內的全光譜信號檢測技術，併申請了專利(Patent US007280204B2)。2013年SONY基於US007280204B2專利授權，開發了全球第一款應用型光譜流式分析儀SP6800，實現了420-800 nm波長范圍內單個細胞的全光譜信號檢測，兼具高速度、高靈敏度、自動化分析和實時光譜解析。正是得益於全光譜信號的加入，光譜流式避免了傳統流式在多色實驗中必須進行補償扣減的步驟，完整保留所有螢光素的全部發射光信號，對弱陽性信號和稀有細胞群體表現出了更好的檢測識別效果。
US007280204B2專利中的光譜流式光路結構原型
2015年SONY公司繼續發布高通量型光譜流式儀SA3800，並在此基礎上結合用戶研究需求和專利優化，SONY公司於2019年為流式領域帶來了全光譜流式技術集大成的重磅產品ID7000，配備了7激光184螢光檢測通道，以高精度的光柵衍射元件實現螢光信號的全光譜線性色散，使用高靈敏度高穩定性的32-ch PMT檢測陣列收集360-920 nm波長范圍內的全部螢光信號，實現了遠超當今市場所有主流流式儀器的超高參數螢光檢測性能。
SONY超高參數全光譜流式分析儀ID7000
光譜流式與傳統流式的異同
1. 儀器構造
傳統流式和光譜流式的區別主要有兩個方面：一是分光方式，傳統流式採用二向鏡和濾光片組合來對不同波段的螢光進行區分，而光譜流式則使用棱鏡或者光柵元件進行全波段的螢光色散；二是信號檢測器，由棱鏡/光柵分光產生的連續光譜信號需要配合線性檢測器陣列（一般是CCD或者多陽極PMT）實現全光譜信號獲取，因而分光能力和檢測器靈敏度二者共同決定了光譜流式的光譜信號分辨率。
傳統流式和光譜流式的光路結構及信號檢測區別
儘管濾光片系統和32-ch PMT陣列間的靈敏度和光譜分辨率有所不同，對於同樣的樣本數據分析而言，兩者可以形成極好的數據一致性，線性回歸係數可達到95%以上。
光譜數據與常規流式數據的一致性對比
（數據來源：DOI: 10.1002/cyto.a.21120）
在激光器的選擇配置上，傳統流式與光譜流式也有明顯差異。傳統流式檢測器和螢光素屬於一對一的關係，不同激光的交叉激發反而帶來更多溢漏及擴散的負面影響，更多激光器配備的負面影響有時甚至高於正面影響；而光譜流式每根激光激發每個螢光素產生的光譜信息都會被捕獲並參與解混運算，激光器越多螢光素間的區分度越好，隨著激光器數量的增加不只拓展了螢光素的選擇範圍，更有效提升了螢光素之間的分辨能力，有助於實現超多色高內涵的流式樣本分析能力，尤其是像ID7000這種多激光超多檢測器的配置能夠突破傳統流式的各種限制。
2. 實驗方案設計
在流式實驗的基礎設置內容上，如儀器校準/抗體滴定/設置生物學對照等，光譜流式和傳統流式並無二致。由於光譜流式將螢光素光譜當作類似指紋的特異性標誌處理，並有能力將此指紋光譜記錄於操作軟件中存儲為光譜庫，故而光譜流式可以省略重複的單染管製備，這種特性可以極大地簡化當前多色流式實驗的操作流程和試劑與樣本用量。
光譜指紋的唯一性支持其可以反復用於光譜數據解析
傳統流式的實驗檢測方案可直接平移至光譜流式。當某一類實驗中樣本光譜攜帶有重要信息時，例如環境敏感性螢光探針和螢光共振能量轉移探針，光譜流式尤顯重要。其中一個重要應用是細胞內源性螢光——自發螢光檢測，自發螢光在流式檢測的背景噪音中佔據重要比例，不同細胞表現出不同的自發螢光，特別是原代異質性組織樣本。奇妙的是，自發螢光和螢光素一樣，具有特定的光譜峰形，這使得光譜流式可以將自發螢光當作某種螢光素來處理，實現從樣本檢測的混合螢光信號中剝離自發螢光，獲取特異性結合的真實螢光信息。
PBMC樣本自發螢光解析
3. 數據分析
對於傳統流式，多色實驗需要檢測單染管計算單染螢光素在其他通道的螢光溢漏比例，建立補償矩陣以實現多色數據的準確分析。對於光譜流式，則有兩類算法用於處理光譜數據：概率先驗性監督算法和無監督的聚類算法。概率先驗性監督算法是基於已知數量的標準光譜作為解析範例，使用螢光單染管計算螢光素光譜特徵，拆分混合螢光信號中各螢光素獨立表達強度和儀器背景噪音，常用算法以泊松分佈最小二乘法為代表。
光譜數據幾種常用的先驗性解析算法
（普通最小二乘法OLS會導致明顯的spread）
源於超多色實驗中越來越多的標記顏色，高維數據也隨之出現，對研究者的數據分析能力提出了更高的要求。為解析流式多維數據，無監督聚類算法應運而生，其是在一切信息未知的前提下，通過漸進因子分析方式從原始光譜數據中提取主要參數信息。圈門（gating），是高維流式數據分析的關鍵步驟。由於gating需要我們對待分析的數據樣本有基本的概要了解，這一步目前仍舊依賴於研究者的手動設置，因而導致了大量的主觀誤差因素。使用無監督的聚類算法則可以避免研究自身主觀因素，實現流式數據的真實呈現。類似的算法工具已在質譜流式的數據處理中展現出了令人激動的分析結果，也因此受到流式領域的普遍認可和接受。
三種常用算法的降維解析結果示意
光譜流式可將每一個光譜通道存儲為數據點，通過聯動分析將其整合為光譜數據raw data，以此實現更深層次的螢光信息獲取。同時亦支持生成標準流式數據FCS文件，配合其他第三方流式軟件實現深度數據分析功能。在同樣的數據分析處理原則上，鑑於光譜流式可以提供更多的螢光信息和marker信息，因而研究者可從光譜流式數據中提煉更多的潛在生物學信息。
結語
將流式當作全光譜流式細胞儀，實現單細胞的全光譜數據分析，是眾多流式廠商一直以來的夢想。如今，伴隨著光路結構/檢測器和電子元器件等部件的成熟，單細胞全光譜流式技術已成為現實。
作為全光譜流式細胞儀領域的開拓者，SONY公司基於自身在光學、電學以及信息分析處理方面的深厚積累，推出了無與倫比的ID7000超高參數全光譜流式分析儀。新穎堅實的光柵分光系統，配合184個PMT螢光檢測陣列，解決了諸多傳統流式束手無策的痛點與難點：超多色panel檢測、光譜數據存儲與重複調用、光譜解析無需再做補償、複雜組織樣本的自發螢光鑑定扣除，以及可無限拓展的未來新型染料檢測能力。
隨著生命科學領域研究的不斷深入，在現今的流式分析領域，相信ID7000會為相關研究者提供更加真實、準確、豐富全面的生物學信息，助力更前沿的科學研究和發展！
SONY超高參數全光譜流式分析儀
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原文來自 索尼生命科學中國：https://mp.weixin.qq.com/s/gfZqOjtf99WU1P7ZHrsStA